Nat Commun| 邹炜研究组发现调控神经元树突形态发育新机制
神经元形成细胞类型特异性的树突形态来接收和整合信号输入。树突形态发育对于精确的神经环路形成至关重要。前人的研究鉴定了树突分支和生长所需的许多内在和外在调节因子。内在调节因子主要包括转录因子、内吞作用和分泌途径、分子马达蛋白和细胞骨架调节因子等。外在调节因子主要是分泌蛋白和发育微环境中定位的细胞粘附蛋白。它们可被树突表面定位的受体识别，以指导树突状分支和生长。敲除上述大多数调节因子通常导致树突分支减少，表明它们中的大多数是正调节因子。然而，负调控树突分支形成的机制还知之甚少。
2024年11月7日，浙江大学转化医学研究院/医学院附属第四医院邹炜研究组和中国科学技术大学生命科学与医学部王朝研究组合作，在《Nature Communications》期刊发表题为《Endocytosis restricts dendrite branching via removing ectopically localized branching ligands》的研究论文，报道了EAT-17和BICD-1等蛋白通过调控树突导向配体蛋白SAX-7内吞，从而抑制神经元在错误的区域形成树突分支的机制。
为了鉴定新颖的树突发育调控因子，该研究团队利用秀丽线虫多树突分支的PVD感觉神经元作为研究模式开展了大规模遗传学筛选，获得了200多个PVD树突发育异常突变体。在野生型中，PVD神经元主要在背部和腹部形成大量高级树突分支，而在侧面区域较少地形成树突分支。在筛选获得的eat-17和bicd-1等突变体中，PVD神经元在背部和腹部区域形成的分支数目减少，而异常地在侧面区域形成大量树突分支（图1）。研究人员分析多个eat-17基因片段删除突变体，发现EAT-17调控树突发育不依赖之前报道的Rab GTPase activating protein（GAP）功能。遗传学拯救实验结果表明EAT-17和BICD-1均在与PVD神经元临近的皮肤细胞中发挥功能。生化分析结果表明二者形成一个蛋白复合物。BICD-1是进化上保守的分子马达dynein接头蛋白。双突变体分析结果表明EAT-17、BICD-1和dynein在同一遗传学通路调控树突形态发育。
图1：敲除eat-17和bicd-1导致PVD神经元在侧面区域产生大量树突分支
前人的研究鉴定了SAX-7/L1CAM是定位在皮肤细胞表面的树突生长和导向配体蛋白。SAX-7和单次跨膜的MNR-1以及由体壁肌肉细胞分泌的LECT-2蛋白形成一个组合型配体复合物；该复合物被定位于树突生长锥的DMA-1/LRRTM蛋白特异性识别。有趣的是，SAX-7在背部和腹部区域形成条纹状结构指导高级树突分支生长和导向，但较少地定位在皮肤细胞的侧面区域。鉴于EAT-17和BICD-1作用于皮肤细胞内调控PVD树突形态发育，研究人员推测二者可能调控了SAX-7蛋白的定位。为检测内源SAX-7蛋白定位，研究人员利用CRISPR/Cas9技术在内源sax-7基因终止密码子上游敲入了绿色荧光蛋白（GFP）编码序列。共聚焦成像结果显示，在eat-17和bicd-1功能缺失突变体中侧面区域的SAX-7::GFP水平与野生型相比显著增高（图2）。
图2：eat-17突变体侧面区域表现出异常累积的SAX-7和树突分支形成
EAT-17和BICD-1如何调控SAX-7定位呢？研究团队提出以下科学假说：EAT-17和BICD-1可能促进定位于侧面区域的SAX-7蛋白进入内吞-降解途径。由于GFP在内体和溶酶体腔等酸性环境下荧光淬灭，研究人员制备了SAX-7::mCherry内源敲入品系，发现SAX-7::mCherry不仅定位于细胞膜上，还少量定位在细胞内的早期内体，以及大量定位在晚期内体和溶酶体中。为了更方便的检测SAX-7从细胞膜至早期内体的转运，研究人员巧妙地表达了持续激活型RAB-5，使得早期内体过度融合但不能转化为晚期内体。在对照组中，SAX-7:: ::mCherry被大量滞留在异常增大的早期内体中；而在eat-17和bicd-1敲低组，内体中含有SAX-7::mCherry的比例显著降低（图3），说明SAX-7蛋白从细胞膜进入内吞途径依赖EAT-17和BICD-1。蛋白质印迹实验结果表明eat-17和bicd-1突变体皮肤细胞内的SAX-7蛋白水平与野生型相比显著增高，这与突变体中SAX-7更多的停滞在细胞膜内而更少地进入内吞-溶酶体途径降解相符。研究者发现敲低或条件性敲除内吞调控基因rab-5和dyn-1也会导致侧面区域出现异常的SAX-7::GFP累积和错误的树突分支形成。遗传学双突变体分析实验结果表明，eat-17、bicd-1、rab-5和dyn-1在同一条遗传学通路调控SAX-7定位和树突形态发育。通过检测早期内体分子标记GFP::RAB-5，研究者发现eat-17和bicd-1对早期内体形成起到了不可或缺的作用（图4）。
图3：SAX-7从细胞膜到内体的运输依赖EAT-17和BICD-1
前人的研究结果表明，PVD神经元可作为本体感受器感知体壁肌肉的收缩-舒张状态，并通过分泌神经多肽NLP-12调控神经-肌肉接头。研究人员发现eat-17突变体表现出严重的本体感受缺陷，说明正确的神经元树突形态发育是神经元执行其功能的基础。
图4：EAT-17和BICD-1调控树突导向配体蛋白SAX-7内吞的模式图
浙江大学医学院博士生方洁、硕士生赵维霞和中国科学技术大学生命科学与医学部博士生蒋文丽为该论文的共同第一作者。邹炜研究员和王朝教授为该论文的共同通讯作者。浙江大学医学院博士生王杰、博士后曹贝贝、本科生王楠和陈宝惠研究员也对本研究做出了重要贡献。该研究项目得到了多个国家自然科学基金项目的经费支持。
