Cullin-RING ligases（CRLs）是最大的泛素E3连接酶家族，介导约20%细胞内蛋白质的泛素化修饰1。不同成员的CRLs成员由不同的亚基组成，其催化亚基共有两种，分别是Rbx1/Roc1和Rbx2/Rnf7/Sag2。孙毅教授课题组前期工作发现，Rbx1或Sag在小鼠的胚胎发育过程中都起到至关重要的作用，无论是敲除敲除Rbx1还是Sag，都会导致小鼠胚胎期死亡，且小鼠胚胎存活时间和死因不同3,4，这表明Rbx1和Sag虽然序列和结构相近，但是并不是功能冗余的，而是具有功能的独立性。

       调节性T细胞（Treg细胞）是一类重要的免疫抑制性细胞，对于维持机体免疫稳态，抑制免疫细胞过度活化发挥重要作用；转录因子Foxp3是Treg细胞重要的标志分子5。一些Foxp3以外的蛋白质也能够调控Treg细胞的功能。

    孙毅教授领导课题组研究人员进一步利用Foxp3Cre-Loxp系统，交配产生Foxp3Cre;Rbx1fl/fl和Foxp3Cre;Sagfl/fl小鼠，在Treg细胞中分别敲除Rbx1和Sag基因。Foxp3Cre;Sagfl/fl小鼠没有明显的炎症反应，小鼠健康可育。Foxp3Cre;Rbx1fl/fl小鼠在出生后30天左右死亡，并出现严重的炎症反应。Treg细胞中敲除Rbx1引发的表型，与在小鼠中去除Treg细胞引发的表型5非常相似，表明Rbx1在Treg细胞中发挥至关重要的调控作用；同时Rbx1和Sag敲除的区别，也进一步验证了Rbx1和Sag功能上相对独立性。

       虽然在Rbx1缺失的Treg细胞，在小鼠出生后逐渐降低；但是在刚刚出生8天的幼鼠体内，Treg细胞比例正常，同时免疫细胞的过度活化就已经很明显了，这表明Rbx1缺失导致Treg细胞免疫抑制功能缺失。

       为了深入研究Rbx1对Treg细胞分化的影响，研究人员使用单细胞转录组测序技术，对野生型和Rbx1缺失的Treg细胞进行分析。通过单细胞转录组测序技术，小鼠Treg细胞可以被进一步分解为10余个亚群，其中的两个亚群在Rbx1缺失的Treg细胞中比例明显降低；而这两个亚群高表达多种Treg细胞的关键功能分子，是效应性Treg细胞亚群。Rbx1缺失导致Treg细胞中静稳亚群无法向效应亚群分化。

       Rbx1是一种泛素E3连接酶，能够催化底物蛋白的泛素化，促进其降解。为了寻找Rbx1在Treg细胞中的底物蛋白，研究人员对Rbx1缺失的Treg细胞进行了质谱蛋白质组检测，分析到了大量蛋白质丰度的变化。结合转录组分析的结果，研究人员找到了57种蛋白质，在Rbx1缺失的Treg细胞中蛋白质丰度升高，且同时对应的mRNA水平基本不变。这57种蛋白很可能是Rbx1介导泛素化的直接底物，特别是其中一些蛋白质已经被证实能够被Rbx1催化发生泛素化修饰，更证明了本策略是可靠的。

       在这57种潜在的Rbx1直接底物中，Bim蛋白也被证实可被Rbx1泛素化并降解，同时Bim与细胞凋亡6和Treg细胞7都有一定关联，因此猜测Bim的积累，很可能部分介导了Treg细胞中Rbx1缺失引发的表型。在Treg细胞中同时敲除Rbx1和Bim，小鼠仍然发生炎症反应，但是强度较单独敲除Rbx1的小鼠要弱一些。表型挽救实验证实Bim确实部分参与了Rbx1在Treg细胞中的功能。

       蛋白质拟素化是一种类泛素化修饰，由类似于泛素化的E1-E2-E3酶促级联反应催化完成；拟素化修饰对于CRLs的活性非常重要，其中拟素化E2耦联酶Ube2m是Rbx1的上游，拟素化E2耦联酶Ube2f是Sag的上游8。在Treg细胞中敲除Ube2f，小鼠没有明显的炎症反应，和敲除Sag相似。令人惊奇的是，在Treg细胞中敲除Ube2m，引发的表型要远远弱于Rbx1缺失引发的，表明在Treg细胞中，Rbx1的功能只是部分依赖于Ube2m，与经典观点不同，暗示了Ube2m-Rbx1调控的复杂性。

图1  Rbx1和Ube2m在Treg细胞功能调节中的工作模型

       相关成果于2022年5月31日在Nature Communications期刊发表（Nat Commun 13: 3021）。浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所和浙江大学转化医学研究院孙毅教授是本文通讯作者。本项目蛋白质质谱研究由国家蛋白质科学中心（北京）秦钧教授课题组开展。浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所吴迪是本文第一作者。项目得到了国家重大研究计划、国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的支持。

参考文献：

1. Soucy, T. A. et al. An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer. Nature 458, 732-736 (2009).

2. Zhao, Y. & Sun, Y. Cullin-RING ligases as attractive anti-cancer targets. Curr. Pharm. Des. 19, 3215-3225 (2013).

3. Tan, M., Davis, S. W., Saunders, T. L., Zhu, Y. & Sun, Y. RBX1/ROC1 disruption results in early embryonic lethality due to proliferation failure, partially rescued by simultaneous loss of p27. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6203-6208 (2009).

4. Tan, M. et al. SAG/RBX2/ROC2 E3 ubiquitin ligase is essential for vascular and neural development by targeting NF1 for degradation. Dev. Cell 21, 1062-1076 (2011).

5. Kim, J. M., Rasmussen, J.P. & Rudensky, A.Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the life span of mice. Nat. Immunol. 8, 191-197 (2007).

6. O'Connor, L., et al. Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. EMBO J. 17, 384-395 (1998).

7. Chougnet, C. A. et al. A major role for Bim in regulatory T cell homeostasis. J. Immunol. 186, 156–163 (2011).

8. Huang, D. T. et al. E2-RING expansion of the NEDD8 cascade confers specificity to Cullin modification. Mol. Cell 33, 483-495 (2009).