脂肪肝病发病率高，严重影响人类健康。在过去几十年中，人们对MASH发病机制的探索和了解不断深入。然而，迄今为止，仅有今年刚刚获批的一种口服小分子药物（Rezdiffra）用于临床治疗MASH成人患者。由于MASH发病机制复杂，人们对其认知仍存在较大的局限性。因此，探索MASH致病新机制，发现新靶点并开发新型有效治疗药物迫在眉睫。

铁是机体必需微量元素，在氧气运输、DNA合成、细胞能量代谢、电子传递和多种酶促反应过程中发挥至关重要的作用。然而，过量的铁蓄积诱发芬顿反应，导致活性氧和脂质过氧化的积累，是铁死亡发生的标志性特征。越来越多的临床研究报道肝铁蓄积与MASH发生存在关联。然而，肝铁过载是否直接导致MASH，目前尚未明确。此外，利用铁螯合剂治疗MASH的方法仍不成熟。为回答上述重要科学问题，作者探索了肝铁蓄积与MASH发生发展的关系，并着重研究铁螯合剂对MASH发展的影响及其潜在机制。与临床使用的铁螯合剂去铁胺(DFO)和地拉罗司(DFX)相比，作者团队研发的新型铁螯合剂FOT1（铁死终结者)在多种小鼠MASH模型中安全有效地缓解MASH疾病的发展。进一步，通过对大型临床脂肪肝病队列分析，作者发现血清铁蛋白(Serum Ferritin, SF)水平在MASH患者中显著升高，尤其是男性，并且与组织学严重程度和纤维化程度呈正相关；此外，通过独立的脂肪肝病临床队列和FOT1治疗后的多个动物MASH疾病模型整合分析，旨在筛选适用于FOT1治疗的MASH患者。

第一部分：人类和小鼠MASH存在肝脏铁蓄积并证明铁蓄积可引发MASH

为了探索肝脏铁在MASH中的作用，作者检测了494名脂肪肝病患者的肝脏铁含量，结果表明与单纯性脂肪肝（MAFL）患者相比，男性B-MASH或MASH患者的肝铁蓄积发生率显著升高，但女性患者没有显示该特征(图1A-1A”)。小鼠实验中，与正常饮食组（ND）相比，蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)、高脂高胆固醇饮食、西方饮食+CCl4等不同MASH疾病造模组小鼠肝组织中铁含量均显著升高。为了确定肝脏铁蓄积在MASH发生发展中的潜在作用，作者研究了高铁饮食(HID)对小鼠肝功能和病理的影响。结果表明，HID喂养的小鼠随着肝铁蓄积的升高，MASH相关的指标也随之显著升高，表明铁蓄积可促进MASH的发生发展。因此，上述发现明确了肝脏铁蓄积与MASH进展之间的因果关系，从而提示祛铁治疗可能是缓解MASH疾病的潜在治疗方法。

第二部分：FOT1铁死终结者显示出治疗MASH疾病的显著疗效

研究者课题组开发研究了1.1类新型铁螯合剂FOT1（曾用名CN128)显示出优良的铁清除能力和安全性。为了探讨铁螯合剂(包括FOT1和两种FDA批准的去铁胺(DFO)和地拉罗司（DFX））在MASH治疗中的潜在作用。首先通过MCD模型进行药物筛选，结果表明，DFO的降肝铁效果不明显且对MCD-MASH治疗效果不明显。FOT1与DFX均显著降低肝铁，并具有显著治疗MASH的作用，但是FOT1效果更为显著。进一步，通过HFHC-MASH模型同样证明了该结论。为了研究FOT1对MASH伴随严重肝纤维化模型的治疗效果，作者采用WD+CCl4造模建立高纤维化评分的晚期MASH模型。结果表明，FOT1对伴随高纤维化评分的MASH患者同样具有良好的治疗效果。

为了探索FOT1对MASH的长期药理作用，作者对HFHC-MASH或WD+CCl4-MASH模型分别给予FOT1或安慰剂进行长期给药治疗。有趣的是，FOT1长期治疗使MASH相关病理指标得到了更为显著的改善。综上所述，FOT1长期治疗可有效预防小鼠MASH的发生进展。

第三部分：FOT1通过抑制ACSL4诱导的铁死亡缓解MASH疾病进程

该团队前期研究表明，肝铁过载可诱发铁死亡促进肝损伤。作者进一步研究发现MASH模型肝组织丙二醛(MDA)、Lipid ROS和4-HNE等铁死亡相关指标显著升高，而铁螯合剂FOT1可显著逆转该过程，表明螯合铁可显著降低MASH模型的铁死亡水平。为了从功能上验证铁死亡在MASH中的积极作用，作者采用铁螯合剂Fer-1对MASH小鼠进行治疗，结果表明Fer-1可以显著缓解MASH的发展。综上所述，这些结果支持铁死亡是肝脏铁蓄积促进小鼠MASH发展的主要下游致病机制。为了进一步阐明FOT1在MASH发展中发挥有益作用的潜在机制，作者首先对ND/HID小鼠肝组织进行RNA测序（RNA-seq）分析，KEGG分析结果显示，肝铁蓄积促进脂代谢通路显著升高，表明MASH中铁代谢紊乱可能诱发脂质代谢紊乱。该结果促使作者通过氧化脂质组学分析MASH模型中铁蓄积诱发铁死亡的原因，作者发现花生四烯酸(AA)代谢通路显著激活，这些改变的代谢物是长链酰基辅酶a合成酶家族成员(由Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5和Acsl6编码)的主要产物。因此作者蛋白表达也随之增加。并且在三个独立的MASH模型中，FOT1治疗显著逆转了这种变化。因此，作者推测FOT1可能通过抑制肝脏Acsl4的表达来阻断MASH的铁死亡。接下来，作者通过ACSL4选择性抑制剂Abemaciclib对MASH模型进行给药治疗。结果表明，Abemaciclib可显著缓解MASH发展。综上所述，铁死亡激活是MASH进展中的关键下游信号通路，FOT1主要通过抑制Acsl4-铁死亡通路缓解MASH进程。

第四部分：c-Myc启动Acsl4介导的铁死亡通路是MASH发生关键机制

为了探索FOT1通过螯合铁抑制Acsl4诱导的铁死亡进而改善MASH的分子机制，作者回顾分析表明，各种MASH模型中Acsl4 mRNA水平显著升高，因此，作者进一步研究铁促进ACSL4转录的调节机制。通过对两种MASH模型的RNA-seq数据分析，作者筛选出两种MASH模型均显著升高且被FOT1逆转的转录因子c-Myc，同时，该现象在三种独立MASH模型中得到了验证。同时，与ND组相比，HID饮食同样显著上调c-Myc。那么c-Myc是否对Acsl4具有转录调控作用呢？通过数据库分析表明，MAFLD患者和MASH小鼠模型Acsl4与c-Myc的表达具有显著相关性。通过双萤光素酶报告实验，作者验证了Acsl4受c-Myc的转录调控，并确认了具体的调控位点。进一步，c-Myc选择性小分子抑制剂10058-F4对MASH模型给药治疗的结果表明，10058-F4可显著抑制ACSL4转录表达并缓解MASH的发展。

第五部分：血清铁蛋白可作为预测FOT1治疗MASH疗效的生物标志物

由于MAFLD患者普遍存在高铁蛋白血症，且代谢性高铁蛋白血症(MHF)与肝损伤严重程度与临床预后有关，作者再次对MAFLD队列Ι进行亚组分析，包括性别分层、MAFLD亚型(MAFL、B-MASH和MASH)、肝铁沉积程度和MHF，从而探讨本研究的潜在临床意义。作者发现，在男性和女性MAFLD患者中，血清铁蛋白(SF)水平与肝脏铁过载或ALT/AST呈正相关。SF水平与MAFLD发病程度呈正相关，MASH患者的SF水平最高，尤其是男性MAFLD患者，而女性患者的SF水平无明显变化。此外，在男性MAFLD患者中，SF水平与NAS或纤维化评分呈正相关，而女性患者未发现该相关性。上述结果与被诊断为MAFLD的男性患者中较高的铁过载比例一致。根据代谢性高铁蛋白血症(MHF)的定义，作者分析发现MAFLD男性患者的高铁蛋白血症患病率较高。男性MAFLD伴随MHF患者的SF水平、肝损伤和NAS均显著高于非MHF患者。而女性MAFLD伴随MHF患者与非MHF患者相比，胰岛素抵抗的严重程度以及ALT和SF水平有显著差异。与MAFLD伴随MHF的女性患者相比，MAFLD合并MHF的男性患者的ALT、SF水平显著较高，肝铁沉积的发生率也较高。此外，作者发现MAFLD伴随肝铁沉积患者的胰岛素抵抗发生率显著较高，并且在MAFLD伴随高SF水平(> 550µg/L)患者中，SF水平与胰岛素抵抗的严重程度呈正相关。根据之前关于MAFLD合并高铁蛋白血症患者临床预后不良的报道，作者现在提供了更多证据来支持以下观点:男性高铁蛋白血症患病率较高，他们可能比其他患者更适合铁螯合剂的治疗。

为了探索SF水平是否可以作为FOT1治疗的分层生物标志物，作者对HFHC-MASH小鼠在FOT1治疗前后的SF水平、ALT/AST、NAS和纤维化评分进行了双盲测定。结果表明，经过FOT1 治疗后，高SF水平的MASH小鼠的预后较好，表现为肝功能明显改善，NAS降低。值得注意的是，作者发现在本研究测试的所有MASH小鼠模型中，FOT1治疗与较低的SF水平显著相关，这表明SF水平可能作为FOT1治疗MASH的预后标志物。有报道表明MAFLD合并MHF分级2/3的患者预后不良，这提示肝铁沉积和高SF水平在MAFLD的发生中发挥关键作用，与此一致，作者的研究提供了可靠的证据支持以下观点:与其它铁螯合剂相比，FOT1在治疗MASH小鼠模型中，具有更安全、更有效的特点。作者对MAFLD患者的亚组分析提示，FOT1可能对MASH合并高铁蛋白血症(SF > 550 g/L)或MHF 2/3级患者更有益。所有这些数据表明，SF水平可能是一个潜在的预测FOT1治疗MASH疾病的生物标志物，更多结果需要未来的临床研究中获得。

南华大学讲师陶亮博士、浙江大学博士后杨鑫泉、浙江大学博士后葛朝东和南华大学硕士生张鹏为论文共同第一作者。

浙江大学闵军霞教授、王福俤教授和温州医科大学郑明华教授为共同通讯作者。浙江大学药学院俞永平教授、陈文腾博士、浙江大学第一附属医院徐承富教授、南华大学硕士研究生何文健、李欣、浙江大学博士研究生徐兴博、博士后余盈盈、博士研究生苏韵星等参与部分实验。

本课题得到国家自然科学基金以及湖南省自然科学基金的资助。感谢浙江大学医学院公共技术平台提供实验支持。

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